癌癥的發(fā)病機制較為復(fù)雜，目前學(xué)界廣泛接受的觀點是相關(guān)基因發(fā)生突變是致癌性轉(zhuǎn)變的根本原因。即在各種因素的影響下：
原癌基因產(chǎn)生突變，導(dǎo)致細(xì)胞無限制生長；
抑癌基因失活，導(dǎo)致細(xì)胞增殖與休眠紊亂，不能正常凋亡。
最終質(zhì)變?yōu)榧?xì)胞及組織水平的變異，導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。
所以癌癥的發(fā)生和發(fā)展實際上是一個較為漫長的過程，在臨床中，完全可以通過基因檢測，達(dá)到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療的目的。
目前，癌癥相關(guān)基因檢測主要基于實時熒光定量PCR（qPCR）和高通量測序（NGS）兩項技術(shù)，其中qPCR具有多項技術(shù)優(yōu)勢：準(zhǔn)確率高、特異性強、靈敏度高、操作簡單、成本較低，被廣泛應(yīng)用于實驗室及臨床診斷中。
今天，我們就來好好聊一聊qPCR
探針法qPCR 技術(shù)原理：
qPCR依據(jù)檢測原理不同，分為染料法和探針法。探針法qPCR需針對目的基因設(shè)計特異性引物與特異性熒光探針，探針的5’端標(biāo)記一個熒光報告基團(tuán)（Reporter，如FAM、VIC、HEX等），3’端標(biāo)記一個熒光淬滅基團(tuán)（Quencher，如TAMRA、BHQ1等）。
當(dāng)熒光探針保持結(jié)構(gòu)完整時，探針與模板退火結(jié)合，其特異性結(jié)合位點位于正反兩條引物之間。5’端報告基團(tuán)受儀器光源激發(fā)的熒光正好被近距離的3’端淬滅基團(tuán)淬滅，儀器檢測不到5′端報告基團(tuán)所激發(fā)的熒光信號。
隨著擴增進(jìn)行，DNA聚合酶在延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針，因其雙鏈特異性的5’-3’外切酶活性，就會切割熒光探針，釋放5’端報告基團(tuán)游離于反應(yīng)體系中，遠(yuǎn)離3’端淬滅基團(tuán)，此時5’端報告基團(tuán)受激發(fā)所產(chǎn)生的熒光信號就可以被儀器檢測到。每擴增一條DNA鏈，就有一個游離的熒光分子形成，熒光信號的強弱與擴增產(chǎn)物量成正比，最終通過數(shù)據(jù)分析實現(xiàn)對初始模板的定量。
圖1. 探針法qPCR技術(shù)原理示意圖
作為一種有效的癌癥篩查檢測及伴隨診斷技術(shù)，探針法qPCR涉及領(lǐng)域涵蓋癌癥的預(yù)防與治療。這項技術(shù)不但能有效地檢測到基因的突變，還可以準(zhǔn)確檢測相關(guān)基因的表達(dá)量。
qPCR應(yīng)用于癌癥篩查
探針法qPCR目前已廣泛應(yīng)用于多種癌癥相關(guān)基因的表達(dá)檢測，包括：
端粒酶hTERT基因
慢性粒細(xì)胞性白血病WT1基因
腫瘤ER基因
前列腺癌PSM基因
宮頸癌相關(guān)病毒HPV
……
其中女性高發(fā)惡性腫瘤之一的宮頸癌，早期發(fā)現(xiàn)并及時治療，可以達(dá)到非常好的療效，治愈率在90%左右。目前已證實高危人乳頭瘤（HPV）病毒持續(xù)感染與宮頸癌有著密切聯(lián)系，因此，對于高危HPV病毒的專項檢測，已成為宮頸癌篩查的重要手段。高危HPV病毒核酸檢測與細(xì)胞學(xué)聯(lián)合篩查被越來越多的應(yīng)用于臨床。
圖2. 高危HPV病毒核酸檢測與細(xì)胞學(xué)聯(lián)合篩查可有效降低漏診率
qPCR應(yīng)用于抗癌藥物研發(fā)
除此之外，探針法qPCR還可應(yīng)用于抗癌藥物的研發(fā)。在新藥的開發(fā)過程中，快速了解藥物對癌癥進(jìn)程的影響可以為新藥開發(fā)節(jié)約大量的人力、時間和資金。
與Elisa等方法相比，探針法qPCR技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確、靈敏地測定血液或組織中目的基因的表達(dá)量，為比較不同配方的療效、用藥量、用藥時間等，提供快速、準(zhǔn)確的評價。
圖3. qPCR檢測流程示意圖
手把手實驗教學(xué)
p53是重要的抑癌基因，幾乎參與所有癌癥的發(fā)生與發(fā)展，其編碼蛋白有促使損傷DNA修復(fù)、損傷細(xì)胞凋亡從而防止癌變的功能。
假設(shè)現(xiàn)在有兩種配方藥物，分別加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，看不同配方藥物對p53 mRNA水平的影響，應(yīng)該怎樣來設(shè)計實驗以及分析結(jié)果呢？
實驗設(shè)計:
分別種三皿細(xì)胞，一皿加入配方一藥物，另外一皿加入配方二藥物，剩下一皿加入對照。處理一段時間之后，分別收集細(xì)胞并提取RNA，再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進(jìn)行qPCR。qPCR如下圖所示進(jìn)行加樣：
圖4. qPCR加樣示意圖
注意區(qū)分 “技術(shù)重復(fù)”和“生物學(xué)重復(fù)”這兩個概念，圖4中p53和β-actin每個實驗組和對照組都各有三個qPCR復(fù)孔，這是技術(shù)重復(fù)，目的是消除本次實驗的操作誤差。生物學(xué)重復(fù)指的是做三次獨立的重復(fù)試驗，目的是消除組內(nèi)誤差、提高結(jié)果的可靠性。在本例中，就要求在其他時間另外再種三皿細(xì)胞，再分別處理后提取RNA，接著再做反轉(zhuǎn)錄和qPCR，如此做了三次獨立重復(fù)實驗之后才能算作三次生物學(xué)重復(fù)，統(tǒng)計誤差的來源應(yīng)該包括生物學(xué)重復(fù)和技術(shù)重復(fù)。
做完上述實驗之后，假設(shè)得到結(jié)果如下：
表1. Test1 Ct值結(jié)果
再做兩次獨立重復(fù)實驗，假設(shè)得到結(jié)果如下：
表2. Test2 Ct值結(jié)果
表3. Test3 Ct值結(jié)果
結(jié)果分析:
下表為完整計算過程（ΔCt=Ct p53-Ct β-actin；ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組）：
表4. 相對表達(dá)量計算方法示例
整理一下數(shù)據(jù)（相對表達(dá)量平均值=2-ΔΔCt平均值）：
表5. p53相對表達(dá)量數(shù)據(jù)
就可以生成p53 mRNA水平的相對表達(dá)量柱形圖了：
圖5. p53 mRNA水平相對表達(dá)量柱形圖
到這里，離獲得實驗結(jié)論只有一步之遙。還需要確定實驗組與對照組之間是否存在顯著性差異。
首先需要確定的是，用什么方法來進(jìn)行檢驗？
因為各實驗組與對照組之間毫無相關(guān)存在，所以應(yīng)該采用獨立樣本t檢驗的方法。可以使用SPSS統(tǒng)計軟件來統(tǒng)計P值，也可以直接使用Excel軟件來進(jìn)行t檢驗。
P<0.05代表存在顯著性差異
P<0.01代表存在極顯著差異
在本例中，配方一實驗組P值<0.01，配方二實驗組P值
配方一藥物處理極顯著提高了p35 mRNA水平的表達(dá)。
配方二藥物處理顯著提高了p35 mRNA水平的表達(dá)。
總結(jié):
需要強調(diào)的是，本文例舉的方法只適用于單因素處理的比較，該因素（本例中為加藥）處理得到的結(jié)果應(yīng)當(dāng)是穩(wěn)定的。在本例中，即表示在相同細(xì)胞中加相同濃度的相同配方藥物，p53 mRNA的變化水平應(yīng)當(dāng)是一致的。
探針法qPCR能夠快捷地提供更加客觀、精確的基因定量檢測結(jié)果，對高發(fā)癌癥的普查和診斷、相關(guān)藥物的研發(fā)具有重要意義。
但這項技術(shù)也存在假陽性導(dǎo)致過度診斷的問題，可采用探針法qPCR同時檢測多個相關(guān)基因，或與其他一些技術(shù)如細(xì)胞學(xué)檢測等結(jié)合應(yīng)用，進(jìn)行綜合性指標(biāo)分析。
康潤生物(GenStar?) 探針法qPCR試劑
重點產(chǎn)品推薦
2×RealStar Fast探針法qPCR預(yù)混液（Cat#A351）
易檢：靈敏度更高，適合低拷貝基因，易檢出。
更快：預(yù)混型一管化設(shè)計，使用方便；可進(jìn)行多重檢測，一次檢出多個基因。
更穩(wěn)：重復(fù)性好，產(chǎn)品性能穩(wěn)定。
更準(zhǔn)：采用抗體型修飾熱啟動酶，特異性好，結(jié)果更準(zhǔn)確。
更低：性價比高，實驗成本更低。
相關(guān)產(chǎn)品信息
