師妹每次提RNA都要整理儀容儀表
實驗臺也是上上下下打掃的非常亮堂
最后再雙手合十，嘴里不知道念叨著什么
這才能開始提取RNA！
這一通騷操作
秀的小編我要拜她為玄學(xué)師父了
哈哈哈~
當然，如果能得到理想RNA，
那我相信各位小主也要拜她為師了！
畢竟對很多同學(xué)來說
提取RNA簡直就是噩夢般的存在
我們來嘮一嘮
如何提取高品質(zhì)的RNA
首先，如何確定RNA質(zhì)量呢？
常用的方法有UV光譜分析、熒光染料、Agilent 2100 Bioanalyzer?、瓊脂糖凝膠電泳等。這里小編重點介紹UV光譜分析和瓊脂糖凝膠電泳法。UV光譜分析
-
A260nm是核酸最高吸收峰的吸收波長，如DNA、RNA、引物等。
-
A280nm是蛋白質(zhì)、酚類最高吸收峰的吸收波長。
-
A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波長，如多肽、苯酚等。
-
A260/A280的比值在1.8-2.2，說明RNA純度較好。
若比值<1.8，說明提取的RNA中存在蛋白質(zhì)、酚類等污染；
若比值>2.2，說明提取的RNA已被DNA污染或者RNA已降解。
-
A260/A230的比值在1.8-2.0，說明RNA純度較好。
若比值小，說明提取的RNA中可能存在糖類、鹽或有機溶劑。
瓊脂糖凝膠電泳
對于真核生物來說，完整的RNA有3個條帶：28S條帶最亮，其次是18S條帶，5S條帶最淡（有些試劑盒提取RNA的過程會將5S條帶過濾掉）。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測28S、18S的條帶亮度比值評估RNA的純度和完整性。
-
若28S和18S條帶清晰、明亮、銳利，且28S條帶亮度約為18S的1.5-2.5倍，則說明RNA質(zhì)量較好。
-
若RNA條帶不亮或缺失，可能與上樣量不足、RNA在凝膠中發(fā)生擴散或降解等因素有關(guān)。
-
若條帶彌散，可能原因有RNA已降解、電泳時電壓或電流過大、上樣量過高或過低等。
-
若條帶大小超過28S，說明可能存在基因組DNA污染，建議使用DNaseⅠ處理。
接下來，當然是提取高品質(zhì)的RNA！
正確儲存樣品
采集組織及細胞之后，應(yīng)立即滅活內(nèi)源性RNase，以防RNA降解。小編與大家分享了3種方法。
-
樣品加入裂解液（如胍鹽）后，立即徹底勻漿。
注：加入裂解液之前必須確保樣品處于冷凍狀態(tài)。 -
使用液氮快速冷凍樣品后再置于-80℃保存。必須保證組織塊足夠小，才能使其浸入液氮的瞬間就能凍結(jié)，以確保RNase瞬間失活。
注：待提取樣品應(yīng)避免反復(fù)凍融。為了確保RNA的提取質(zhì)量，請盡量使用新鮮樣品。
-
將樣品充分浸泡在RNA穩(wěn)定劑中。它是一種無毒、水相收集試劑，可穩(wěn)定并保護完整、未冷凍的組織和細胞樣品中的RNA。
注：組織樣品切片一定要薄（<0.5 cm），以便在RNase破壞RNA之前穩(wěn)定劑迅速滲透組織。
RNA提取純化前的準備工作
-
所有物體表面（如實驗儀器、工作臺面）可用去RNase污染的溶液擦拭。
-
建議設(shè)立RNA抽提專區(qū)，實驗用的器具亦可專用。
-
使用的玻璃器皿可進行150℃干熱滅菌4小時的處理。
-
塑料器皿可用0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在室溫或37℃處理12小時，然后再高溫高壓滅菌以除去殘留的DEPC，或者在0.5 M NaOH中浸泡10 min，然后用水徹底清洗再滅菌烘干，即可去除RNase。
-
采用無菌操作規(guī)程，注意經(jīng)常更換新手套，以避免RNase污染。
選擇合適的RNA提取純化方法
(1)溶液法
又稱異硫氰酸胍/苯酚法、TRIzol法。異硫氰酸胍不僅僅是一種強蛋白變性劑，而且也是很強的RNase抑制劑。苯酚的主要作用是裂解細胞，使細胞中蛋白質(zhì)、核酸物質(zhì)解聚，從而釋放核酸。這種方法簡便快捷，適用于動植物細胞、組織、酵母細胞、細菌等多種樣品的總RNA提取。
(2)離心柱法
離心柱的材料通常是玻璃纖維、硅衍生物或者離子交換膜，可以在特定適宜的條件下特異、可逆地結(jié)合RNA。操作過程更加方便快捷，且提取的RNA純度較高，可是存在著有物種特異性、價位較高等不足。
提取過程中需要注意
(1)徹底勻漿樣品
細胞或組織的充分勻漿能夠減少RNA的損失和降解。大部分培養(yǎng)細胞加入細胞裂解液后，使用吸管或加樣器吹打等較溫和的方式勻漿。而組織樣本、酵母以及細菌通常使用更加劇烈的方式，例如細菌就需要用酶消化其細胞壁，從而保證細胞充分裂解和RNA的提取得率。
(2)RNA的正確沉淀
一般情況下，可使用異丙醇來沉淀RNA。也有使用共沉淀劑（如Glycogen、Linear Acrylamide）來輔助進行RNA沉淀的特殊情況，以滿足一些下游應(yīng)用的需要。注意沉淀后應(yīng)避免過于干燥，以防RNA沉淀難以重新溶解。
(3)RNA的重懸
許多RNA提取步驟的最后一步操作就是溶解純化的RNA沉淀，通常使用DEPC處理水進行重懸溶解即可，也有使用特殊的重懸溶液的情況。理想的重懸溶液應(yīng)該滿足三點要求：無RNase污染、較低的pH值（pH 6-7）、含有螯合劑，以保護RNA不被帶入的RNase降解。為了幫助溶解，RNA沉淀置于重懸溶液后可在50 ~ 60℃溫度下孵育5 min，并不時輕搖以加速溶解。
(4)RNA的保存
重懸的RNA若需短期保存，可置于-20℃。或者將其適量分裝后置于-65 ~ -80℃長期保存，避免反復(fù)凍融。值得注意的是RNA的半衰期比較短、易降解，建議抽提后盡快進行后續(xù)實驗。
重點來啦！總RNA提取需要一款優(yōu)秀的試劑
GenStar明星產(chǎn)品推薦：TRIGene總RNA提取試劑（Cat# P118）
-
通用性強：適用于動植物細胞、組織、酵母細胞、細菌等多種樣品的總RNA提取。
-
一劑多用：同一樣本可提取總RNA、DNA和蛋白質(zhì)。
-
提取率高：每1×106培養(yǎng)細胞可提取約10 μg總RNA。
-
性價比高：貼心的價格，高品質(zhì)的結(jié)果。
GenStar相關(guān)優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品
